Pregabalin ni agonist receptorjev GABAA ali GABAB.
Pregabalin je gabapentinoid in deluje tako, da zavira določene kalcijeve kanale. Natančneje je ligand pomožnega mesta podenote α2δ nekaterih napetostno odvisnih kalcijevih kanalov (VDCC) in tako deluje kot zaviralec VDCC, ki vsebuje podenoto α2δ. Obstajata dve podenoti α2δ, ki se vežeta na zdravilo, α2δ-1 in α2δ-2, in pregabalin kaže podobno afiniteto za ti dve mesti (in s tem pomanjkanje selektivnosti med njima). Pregabalin je selektiven pri vezavi na podenoto α2δ VDCC. Kljub dejstvu, da je pregabalin analog GABA, se ne veže na receptorje GABA, se in vivo ne pretvori v GABA ali drug agonist receptorja GABA in ne modulira neposredno transporta ali presnove GABA. Vendar je bilo ugotovljeno, da pregabalin povzroči od odmerka odvisno povečanje možganske ekspresije dekarboksilaze L-glutaminske kisline (GAD), encima, ki je odgovoren za sintezo GABA, in ima zato lahko nekatere posredne GABAergične učinke s povečanjem ravni GABA v možganih. Trenutno ni dokazov, da so učinki pregabalina posredovani s kakršnim koli drugim mehanizmom razen z inhibicijo VDCC, ki vsebujejo α2δ. V skladu s tem se zdi, da je zaviranje VDCC, ki vsebujejo α2δ-1, s pregabalinom odgovorno za njegove antikonvulzivne, analgetične in anksiolitične učinke.
Endogeni α-aminokislini L-levcin in L-izolevcin, ki sta po kemijski strukturi zelo podobni pregabalinu in drugim gabapentinoidom, sta očitna liganda podenote α2δ VDCC s podobno afiniteto kot gabapentinoidi (npr. IC50 = 71 nM za L- izolevcin) in so prisotni v človeški cerebrospinalni tekočini pri mikromolarnih koncentracijah (npr. 12,9 μM za L-levcin, 4,8 μM za L-izolevcin). Obstaja teorija, da so lahko endogeni ligandi podenote in da lahko konkurenčno antagonizirajo učinke gabapentinoidov. Skladno s tem, medtem ko imajo gabapentinoidi, kot sta pregabalin in gabapentin, nanomolarno afiniteto za podenoto α2δ, so njihove moči in vivo v nizkem mikromolarnem območju, za to neskladje pa naj bi bilo verjetno odgovorno tekmovanje za vezavo z endogenimi L-aminokislinami.

V eni študiji je bilo ugotovljeno, da ima pregabalin 6-krat večjo afiniteto kot gabapentin za VDCC, ki vsebujejo podenoto α2δ. Vendar pa je druga študija pokazala, da imata pregabalin in gabapentin podobne afinitete za človeško rekombinantno podenoto α2δ-1 (Ki = 32 nM oziroma 40 nM). V vsakem primeru je pregabalin 2- do 4-krat močnejši od gabapentina kot analgetik in se zdi, da je pri živalih 3- do 10-krat močnejši od gabapentina kot antikonvulziv.