Pregabalin ni agonist receptorjev GABAA ali GABAB.
Pregabalin je gabapentinoid in deluje tako, da zavira določene kalcijeve kanale.Natančneje, je ligand pomožnega mesta podenote α2δ nekaterih napetostno odvisnih kalcijevih kanalov (VDCC) in tako deluje kot inhibitor VDCC, ki vsebujejo α2δ podenoto.Obstajata dve podenoti α2δ, ki vežeta zdravilo, α2δ-1 in α2δ-2, in pregabalin kaže podobno afiniteto za (in s tem pomanjkanje selektivnosti med) tema dvema mestoma.Pregabalin je selektiven pri vezavi na podenoto α2δ VDCC.Kljub temu, da je pregabalin analog GABA, se ne veže na receptorje GABA, se ne pretvori v GABA ali drug agonist receptorjev GABA in vivo in ne modulira neposredno transporta ali presnove GABA.Vendar je bilo ugotovljeno, da pregabalin povzroči od odmerka odvisno povečanje možganske ekspresije dekarboksilaze L-glutaminske kisline (GAD), encima, odgovornega za sintezo GABA, in ima zato lahko nekatere posredne GABAergične učinke s povečanjem ravni GABA v možganih.Trenutno ni dokazov, da učinke pregabalina posreduje kateri koli mehanizem, razen inhibicije VDCC, ki vsebujejo α2δ.V skladu s tem se zdi, da je zaviranje VDCC, ki vsebujejo α2δ-1, s pregabalinom odgovorno za njegove antikonvulzivne, analgetične in anksiolitične učinke.
Endogeni α-aminokislini L-levcin in L-izolevcin, ki sta po kemični strukturi zelo podobna pregabalinu in drugim gabapentinoidom, sta očitno liganda podenote α2δ VDCC s podobno afiniteto kot gabapentinoidi (npr. IC50 = 71 nM izolevcin) in so prisotni v človeški cerebrospinalni tekočini v mikromolarnih koncentracijah (npr. 12,9 μM za L-levcin, 4,8 μM za L-izolevcin).Teoretizirali so, da so lahko endogeni ligandi podenote in da lahko kompetitivno antagonizirajo učinke gabapentinoidov.Medtem ko imajo gabapentinoidi, kot sta pregabalin in gabapentin, nanomolarno afiniteto za podenoto α2δ, so njihove moči in vivo v nizkem mikromolarnem območju in naj bi bila konkurenca za vezavo endogenih L-aminokislin verjetno odgovorna za to neskladje.

V eni študiji je bilo ugotovljeno, da ima pregabalin 6-krat večjo afiniteto kot gabapentin za VDCC, ki vsebujejo α2δ podenoto.Vendar pa je druga študija pokazala, da imata pregabalin in gabapentin podobne afinitete za človeško rekombinantno α2δ-1 podenoto (Ki = 32 nM oziroma 40 nM).Vsekakor je pregabalin kot analgetik 2 do 4-krat močnejši od gabapentina, pri živalih pa se zdi, da je 3 do 10-krat močnejši od gabapentina kot antikonvulziv.